植物RNA提取試劑盒（DNase I）說明書
RNApure Plant Kit（DNase I）
植物 RNA 提取試劑盒（DNase I）說明書
Cat. No. K0559
保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20 ℃
其它組分：室 溫
組分說明
Cat No. K0559
Kit Size 50
DNase I 1000 U
10×Reaction Buffer 1000 μl
Buffer RL 35 ml
Buffer RLC 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2（concentrate） 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Shredder Spin Column 50
Spin Columns RM 50
Collection Tube（1.5 ml） 50
Collection Tube（2 ml） 100
產品簡介
本試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質總 RNA，也適用于真菌菌絲 RNA 的提取。*的 Shredder 分離柱，用于
勻質化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時采用硅基質膜吸附 RNA 進行純化，使多聚糖等各種污染物通過洗滌被有效
去除，經洗脫的RNA可直接用于各種下游實驗。由本試劑盒提取RNA分子量大于 200 堿基，純度高，幾乎無DNA殘留。
如果是對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實驗，殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase 在柱上進行消化去除。提取的 RNA
可用于 Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR 和體外翻譯等實驗。
注意事項
1. 預防RNase污染，應注意以下幾方面：
1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2）玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3）配制溶液應使用無RNase的水。
4）操作人員戴一次性kou'zhao和手套，實驗過程中要勤換手套。
2. 提取的樣品避免反復凍融，否則影響 RNA 提取的量和質量。
3. Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個月。Buffer RLC 使用時不需加β-巰基乙醇。
4. 第-次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。
5. Buffer RL 和 Buffer RLC 如果產生沉淀，請加熱使其溶解后室溫放置。
6. 所有離心步驟均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。
自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA）
操作步驟
1. 50-100 mg植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入600 μl Buffer RL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇）或Buffer RLC。渦旋振蕩使其充分裂解。
注意：1）Buffer RL主要成分為異硫氰酸胍，適用于大多數植物組織的裂解。但有些植物組織（如玉米的胚乳），由于次級代謝產物較特殊，異硫氰酸胍使樣品產生沉淀，導致RNA提取效果不佳，此時可加入Buffer RLC替代Buffer RL。
2）56℃孵育1-3分鐘有助于組織的裂解，但是淀粉含量高的植物不要進行高溫孵育。
2. 將步驟1所得全部液體轉移至已裝入RNase-Free 2 ml收集管（RNase-Free 2 ml Collection Tube）的Shredder Spin Column中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘，將收集管中的上清液轉移到一個新的離心管（自備）中。
注意：1）在吸取液體時可以將槍頭剪掉，便于取樣。
2）Shredder Spin Column可以除去大部分的碎片，但仍會有小部分流出，離心后會在收集管內形成沉淀，在進行下一步時注意避免吸到沉淀。
3. 在步驟2所得干凈的裂解液中加入0.5倍體積的無水乙醇，迅速混勻。
注意：加入乙醇后可能會產生沉淀，但不影響后續試驗。
4. 將上步得到的溶液轉移到吸附柱（Spin Columns RM）中（吸附柱已裝入收集管中）,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉入; 10,000 rpm（~8,000 x g）離心15秒，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6. 配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1U/μl），混勻， 配制成終體積為80 μl的反應液。
7. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分鐘。
8. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 10,000 rpm離心15秒,棄廢液。
10. 重復步驟9。
11. 將吸附柱放回收集管中，12,000 rpm離心1分鐘，將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR等)。
12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free 1.5 ml 收集管中，向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，10,000 rpm離心1分鐘，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。
注意：1） RNase-Free Water 體積不應小于 30 μl，體積過小影響回收率。
2） 如果要提高RNA的產量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟12。
3） 如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟12。
實驗代做服務：
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