酵母RNA提取試劑盒( DNase I )說明書
RNApure Yeast Kit ( DNase I )
Cat. No. K0629
保存：Lyticase、DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃
其它組分：室溫
組分說明
Catalog no. K0629
Kit Size 50
DNase I 1000 U
10×Reaction Buffer 1000 μl
Buffer RL 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2（concentrate） 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Lyticase Working Buffer 30 ml
Lyticase 300 μl
Spin Column RM 50
Collection Tube（1.5 ml） 50
Collection Tube（2 ml） 50
產品簡介
本試劑盒用于常見的各種真菌的總 RNA 的快速提取。既可以提取液體培養物，也可以直接提取固體培養基上的真菌菌落。操作簡單快捷，單個樣本 30 分鐘內可以完成提取全過程，所提 RNA 純度高，OD260/280一般都在 2.0 左右。提取的 RNA
適用于 RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern Blot 、cDNA 合成等實驗。
注意事項
1. 預防RNase污染，應注意以下幾方面：
1） 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2） 玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3） 配制溶液應使用無RNase的水。
4） 操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。
2. 樣品應避免反復凍融，否則會影響RNA提取的的量和質量。對于有些細胞壁較厚以及在培養階段會產生大量代謝物的酵母，最好在生長的早期就收集樣品。
3. 使用前請檢查Buffer RL是否出現結晶或者沉淀，可置于56℃水浴重新溶解。Buffer RL在使用前請加入β-巰基乙醇，至終濃度為1%。如1 ml Buffer RL加10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer RL室溫可保存1個月。
4. Lyticase Working Buffer在使用之前應加入β-巰基乙醇，1 ml的Lyticase Working Buffer加入10 μl的β-巰基乙醇，加入β-巰基乙醇的Lyticase Working Buffer可以在室溫下儲存1個月。
5. 第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在Buffer RW2中加入無水乙醇。
自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA專用）、70%乙醇（用無RNase的水配制）
操作步驟
1. 取約1-5 ml 酵母培養物，12,000 rpm（~13,400×g）離心1分鐘，盡量吸取全部上清（菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。
注意：酵母培養物最多不超過3×107個細胞，一般對于釀酒酵母OD600值為1.0時，相當于1-2×107細胞/ml。
2. 酵母細胞壁的去除：向菌體中加入600 μl Lyticase Working Buffer（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇，使其終濃度為1%）,并加入5μl Lyticase（10 U/μl），充分混勻，并在搖床上220 rpm/min，30℃處理30分鐘。4,000 rpm（~1,500×g）離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。
注意：以上為3×107 個酵母細胞Lyticase用量，根據酵母的菌株和酵母細胞數量的不同，所用的Lyticase的濃度和孵育時間應該進行適當調整。
3. 向沉淀中加入350 μl Buffer RL（使用前加入終濃度為1%的β-巰基乙醇）反復吹打幾次，使其充分裂解。如果有可見不溶物，最大轉速離心2分鐘，取上清進行下一步。
注意：盡量使細胞充分懸浮并充分裂解否則影響RNA產量。
4. 向步驟3所得到的溶液中加入1倍體積（350 μl）的70%乙醇（RNase-Free Water配制），混勻。
5. 將步驟 4 所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉入。12,000 rpm 離心 15 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉入。
6. 向吸附柱中加入 350 μl Buffer RW1，10,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
7. 配制 DNase I 混合液：取 52 μl RNase-Free Water，向其中加入 8 μl 10 × Reation Buffer 和 20 μl DNase I（1U/μl），混勻， 配制成終體積為 80 μl 的反應液。
8. 向吸附柱中直接加入 80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育 15 分鐘。
9. 向吸附柱中加入 350 μl Buffer RW1, 12,000 rpm 離心 15 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入 500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）,12,000 rpm 離心 15 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
11. 重復步驟 10。
12. 12,000 rpm 離心 2 分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR 等）。
13. 將吸附柱置于一個新的無 RNase 離心管（Collection Tube 1.5 ml），向吸附柱的中間部位懸空加入 30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置 1 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘，收集 RNA 溶液，-70℃保存。
注意：1）RNase-Free Water 體積不應小于 30 μl，體積過小影響回收率。
2）如果要提高 RNA 的產量，可用 30-50 μl 新的 RNase-Free Water 重復步驟 10。
3）如果要提高 RNA 濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟 10。
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